物种的系统发育树可以展现地球上现存物种间的进化关系。与之类比，在微观尺度上，细胞谱系树可以描述一个生物个体所有细胞的亲缘关系。解析单个受精卵后代细胞间谱系关系对于理解发育生物学问题具有重要意义。近年来，随着高通量测序技术的发展，体细胞的突变信息被用于细胞谱系追踪，但细胞基因组本底复制突变率极低，往往依赖于昂贵的单细胞全基因组测序才能获得足够的谱系突变，这限制了谱系追踪记录的细胞数量。因此，研究者着力于发展基于外源高效突变的DNA条形码技术(DNA barcoding)，在DNA条形码上靶向制造突变并使用该突变来记录细胞分裂的谱系历史。然而目前，发育生物学研究的重要模式生物斑马鱼仍缺乏高效的细胞谱系追踪系统。现有的基于CRISPR-Cas9的细胞条形码技术由于突变率低，产生的大片段缺失会删除先前记录的突变等原因，无法记录胚胎发育过程中的大部分细胞分裂事件。
2024年4月15日，Journal of Genetics and Genomics在线发表中山大学生命科学学院贺雄雷教授团队题为“Achieving single-cell-resolution lineage tracing in zebrafish by continuous barcoding mutations during embryogenesis”的研究论文。该研究将基于单碱基突变的细胞谱系追踪系统SMAL (substitution mutation aided lineage tracing system)应用于斑马鱼，通过重新设计DNA条形码，开发出一套高精度、可追踪斑马鱼多个组织或器官细胞谱系历史的系统，并利用该系统重构了斑马鱼鱼鳍发育与再生的细胞谱系树，研究生殖细胞的谱系来源与克隆组成。
研究团队首先重新设计了与之前SMALT系统具有相同突变蛋白结合位点数目，但序列更短更易PCR扩增的1 kb条形码。该条形码具有极大的标记空间，含超过500个潜在突变位点，在受精后1天斑马鱼胚胎中记录的突变中位数可达14个，能够记录胚胎发育中大多数细胞分裂事件。使用该谱系追踪系统，研究团队对斑马鱼成鱼所有部位鱼鳍进行截取再生取样，构建了四个各自具有数千个终端细胞和数百个有效中间节点的高精度细胞谱系树，所有谱系树的稳健性支持(bootstrap value)中位数达到99%。细胞谱系树分析发现，鱼鳍损伤再生后的细胞主要来源于这一位置原本细胞的后代。此外，通过对同一个体多次产卵取样，从细胞谱系上验证了在胚胎发育中生殖细胞和体细胞祖先细胞的早期分离。
斑马鱼单碱基突变的细胞谱系追踪系统突变制造示意图
综上所述，该系统为斑马鱼多个组织或器官进行高精度的细胞谱系追踪提供了工具，为解析脊椎动物发育稳健性和细胞命运决定机制等发育生物学重大问题提供新的参考。
作者简介
中山大学生命科学学院博士研究生刘湛为该论文第一作者，贺雄雷教授为该论文通讯作者，曾慧、向慧敏和邓善俊为共同作者。相关工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委等项目资助。
引用本文
Zhan Liu, Hui Zeng, Huimin Xiang, Shanjun Deng, Xionglei He. (2024). Achieving single-cell-resolution lineage tracing in zebrafish by continuous barcoding mutations during embryogenesis. Journal of Genetics and Genomics.
