2020年，瑕瑜课题组在Journal of the American Society for Massspectrometry杂志上发表了题为“Mapping Complex Disulfide Bonds via ImplementingPhotochemical Reduction Online with Liquid Chromatography-Mass Spectrometry”的论文。本文的通讯作者是清华大学化学系瑕瑜教授，其指导的清华大学化学系博士生杨晓月为本文第一作者。

二硫键是多肽蛋白中两个半胱氨酸侧链之间形成的重要翻译后修饰。二硫键的动态裂解和形成在调节细胞氧化还原稳态，酶催化和蛋白质功能中具有重要意义。分泌蛋白通常含有多个二硫键，这些二硫键能够在细胞外环境中稳定蛋白质结构。随着药物开发进入大分子时代，二硫键常常被用来提高蛋白质药物的稳定性。但二硫键作为一种翻译后修饰，无法直接由遗传信息预测，而且很容易受到化学或生物环境变化的影响，因此表征二硫键连接方式是蛋白质鉴定的重要步骤。由于传统化学还原方法难以实现可控部分还原，含有多个二硫键的酶解片段在自下而上的蛋白质组学工作流程中难以鉴定。此前，瑕瑜课题组发表了运用丙酮/ 异丙醇（IPA）光引发系统实现快速（秒级）可控二硫键还原的工作（10.1021/acs.analchem.8b04019）。在此工作中，作者们将此反应和液相色谱-质谱（LC-MS）结合以提高自下而上的蛋白质分析流程对含复杂二硫键的蛋白质的分析能力。

为了将光化学反应在线引入LC-MS, 作者使用T 型三通将光引发剂（10%丙酮90%异丙醇）并入LC 流出液，其随即进入微反应器（254 nm 紫外光照），经过0-15 秒反应后经电喷雾离子源电离。二硫键的还原程度通过调节反应时间可以灵活实现部分还原或完全还原。对部分还原的调控的实现使得对酶解肽段中含多个 （2-3个）复杂二硫键的分析成为可能。

作者们用非还原酶解的溶菌酶（Lysozyme, 4个二硫键）和牛血清白蛋白（BSA，17个二硫键）进行测试。在线光化学还原使溶菌酶的序列覆盖率从35％提高到100％，BSA则从13％提高到87％。溶菌酶的所有4个二硫键的连接方式都能够被准确确定。由于BSA 中含两个紧邻链间二硫键的肽段，部分还原的产率较低，在BSA中17个二硫键中的9个能够被完全表征，8个紧邻的二硫键的定位范围可以被缩小。

总体而言，光化学反应和反相液相色谱-质谱系统相结合增强了自下而上的蛋白质分析流程对模型蛋白（溶菌酶和牛血清白蛋白）中二硫键连接方式的鉴定能力。微流反应器相对传统化学反应具有反应快速（0-15秒）并且可调节（从部分还原到完全还原）的优势。瑕瑜课题组将致力于开发新的光化学系统来更好地实现部分还原。

本文编辑：杨晓月

审阅：张龙飞

本文链接：https://doi.org/10.1021/jasms.0c00324

本文引用：10.1021/jasms.0c00324