近期，瑕瑜课题组开发了一种基于CID引发的自由基诱导解离（RDD）的串联质谱分析方法应用于表征鞘氨醇的精细结构，该策略结合反相液相色谱（RPLC）分离实现了复杂生物样品中总鞘氨醇的定性定量解析。相关工作“In-Depth Characterization of Sphingoid Bases via Radical-Directed Dissociation Tandem Mass Spectrometry”近日发表在J. Am. Soc. Mass. Spectrom.上。该文第一作者为清华大学化学系博士生赵婧，通讯作者为瑕瑜教授。该课题得到国家自然科学基金（No. 22225404，22074075）的支持，北京生命科学研究所董梦秋课题组博士生罗惠为该工作提供了线虫脂质提取物样品。
鞘氨醇是鞘脂类的基本组成单元，如图1所示，鞘氨醇的头部基团、链长以及化学修饰的变化（例如甲基分支、双键和羟基化），使鞘氨醇具有广泛的结构多样性和独特的功能特性。各类生物体中均具有其代表性的鞘氨醇结构。鞘烯（SPH d18:1）是哺乳动物细胞中主要的鞘氨醇，而植物、真菌和水生生物中的鞘氨醇更具结构多样性。草药琉璃苣（Borago officinalis）中Δ8-鞘脂去饱和酶诱导在C8和C9之间形成一个C=C双键，产生SPH t18:1(Δ8)；秀丽隐杆线虫（C. elegans）的代表性鞘氨醇是含有甲基支链的C17鞘氨醇。鞘氨醇类似物，如来自天然产物的化学衍生物芬戈莫德（fingolimod），已被开发成用于多发性硬化症和自身免疫性疾病的治疗药物。然而，传统的串联质谱（MS/MS）通过碰撞诱导解离（CID）在表征鞘氨醇时难以定位其链内极性基团、C=C双键和支链的位置，需要发展新方法来实现鞘氨醇精细结构的深度解析。
图一. 鞘氨醇的常见结构
CID中偶电子离子通常在电荷定向碎裂中发生共价键异裂。RDD与之不同，其碎裂与键的极性相关性低，可以沿研究者将所建立的流程应用于牛心脏和线虫中鞘氨醇的结构解析，如图三所示，所提取的脂质经过酸水解产生游离的鞘氨醇，然后进行后续的TPN-RPLC-MS/MS分析。在牛心脏中，除了主要的鞘氨醇SPH d18:0和SPH d18:1外，研究者还鉴定出含有奇数碳链（SPH d17:0）和多不饱和（SPH d18:2(4, 14) ）的鞘氨醇。在线虫中，除了高丰度的SPH id17:1和SPH id17:0，研究者鉴定出10余种低丰度鞘氨醇（相对于总量<5%），并发现奇数碳链鞘氨醇均含有末端支链，偶数碳链则为直链；结合PB-MS/MS的验证，研究者还发现了一种含量约为0.03%、含有末端支链的多不饱和鞘氨醇SPH id17:2(4, 13)。着脂质的烷基链发生丰富的碎裂行为，从而得到与链修饰相对应的特征碎片。RDD方法通常需要结合化学衍生化和串联质谱技术，先在目标脂质中引入自由基前体，再在气相中活化离子释放自由基并启动RDD。最早，Blanksby小组设计将含光敏自由基前体的4-碘苯甲酸酯与鞘磷脂形成非共价复合物，通过紫外光诱导解离断裂芳香碳-碘键释放苯基自由基，从而得到鞘磷脂的酰基链上的RDD图谱。瑕瑜课题组近年来专注于采用CID来生成脂质自由基离子，引发RDD以分析脂质精细结构。赵雪等人发现鞘磷脂的碳酸氢根负离子加合物的MS2 CID可以产生磷酸乙基自由基，进而引发酰基链上的RDD通道，基于该裂解模式，鉴定得到了线虫中鞘磷脂的酰胺羟基化和烷基链中的甲基分支的相关信息。简瑞君等人利用o-苄基羟胺（o-BHA）中可解离的C-O键（键解离能量为32 kcal/mol），开发了针对支链脂肪酸的定性定量流程。3-(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧甲基)-吡啶酸2,5-二氧吡咯啉-1-酯（TPN）最初由高金山课题组开发用于疏水性肽的自由基启动测序（FRIPS）。C-O键相对较低的BDE（30 kcal/mol）有助于在CID下失去2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧自由基（TEMPO·，156 Da），然后在肽骨架内引发RDD。瑕瑜课题组林巧红等人随后证明了TPN衍生的磷酸乙醇胺也可以经CID-RDD定位甲基分支、环丙烷和羟基修饰。在本工作中，研究者进一步扩展了TPN-RDD的应用范围，如图二所示，鞘氨醇经TPN衍生后，在CID下失去TEMPO·自由基，得到吡啶甲基自由基，该自由基可以夺取碳链上的任意质子，从而诱发RDD碎裂，由于烯丙基自由基较乙基自由基的稳定性，SPH id17:0对应的CID谱图中m/z 361（-C3H7·）的信号明显增强，且没有m/z 375（-C2H5·），与直链SPH d17:0连续相隔14 Da的特征峰不同，其28 Da间隔的特征离子可实现支链位置的鉴定。RPLC分离结合RDD的鉴定信息，我们可以通过MRM对两种异构体进行定性定量解析，检测限为5 nM。
图二. TPN-RDD实现鞘氨醇精细结构解析的示意图及其应用于SPH d17:0和SPH id17:1的MS2 CID谱图，LC谱图和定量曲线。
研究者将所建立的流程应用于牛心脏和线虫中鞘氨醇的结构解析，如图三所示，所提取的脂质经过酸水解产生游离的鞘氨醇，然后进行后续的TPN-RPLC-MS/MS分析。在牛心脏中，除了主要的鞘氨醇SPH d18:0和SPH d18:1外，研究者还鉴定出含有奇数碳链（SPH d17:0）和多不饱和（SPH d18:2(4, 14) ）的鞘氨醇。在线虫中，除了高丰度的SPH id17:1和SPH id17:0，研究者鉴定出10余种低丰度鞘氨醇（相对于总量<5%），并发现奇数碳链鞘氨醇均含有末端支链，偶数碳链则为直链；结合PB-MS/MS的验证，研究者还发现了一种含量约为0.03%、含有末端支链的多不饱和鞘氨醇SPH id17:2(4, 13)。
图三. TPN-RPLC-MS/MS应用于复杂样品中鞘氨醇解析示意图，以及牛心和线虫中鉴定出的鞘氨醇信息和对应的色谱洗脱时间。
总的来说，本工作所开发的分析流程具有研究各种生物系统中鞘脂代谢的潜力。目前受TPN中NHS的特异性限制，尚不能应用于缺乏游离胺基的完整复杂鞘脂，如神经酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂，为了克服这一限制，未来的工作可尝试发展与复杂鞘脂形成共价或非共价复合物的RDD试剂。
编辑：赵婧
审核：乔利鹏，瑕瑜
