氧化甘油磷脂酰乙醇胺（oxPEs）是一类生物活性脂类，在各种生理、病理过程中扮演着复杂的角色。传统的质谱方法不能提供oxPEs中OH及C=C的准确位置信息；对于OH来说，其诊断离子往往缺乏足够的特异性。近日，清华大学化学系瑕瑜教授课题组在Analytical Chemistry上发表了以“Characterization of Oxidized Glycerophosphoethanolamines via Radical-Directed Dissociation Tandem Mass Spectrometry and the Paternò-Büchi Derivatization”为题的文章，该文第一作者为清华大学化学系博士生林巧红。该课题得到了国家自然科学基金(No. 22225404)和国家重点研发计划(No. 2018YFA0800903)的支持。在这项工作中，作者报道了一种可对oxPE实现深入结构表征的组合策略，如图1所示，此策略包括：自由基诱导解离串联质谱（RDD-MS/MS）定位OH基团及Paternò-Büchi衍生偶合串联质谱（PB-MS/MS）定位C=C。
图1
此前，作者用自由基引发剂3-(2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yloxymethyl)-picolinic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester（TPN）或5-(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yloxymethyl) nicotinic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester（TBN）对PE进行衍生化，并在MS2 CID下高效产生了脂质自由基离子（丢失TEMPO）。在本文中，作者发现TPN/TBN衍生产物在负离子MS2 CID下可产生脂质自由基离子（TPN，m/z 900.6），随后发生在脂肪酰基链上的RDD生成了可指示OH位点的诊断离子m/z 829.5、801.5、799.5（图2a），其中m/z 829.5的RDD机理如图2b所示。量子化学计算结果表明，在空间上脂质自由基离子中的OH位于吡啶甲基自由基附近，吡啶甲基自由基优先夺取OH中氢原子，其活化能（15.4 kcal/mol）低于夺取与OH相邻的烯丙基氢的活化能（63.9 kcal/mol）。TPN/TBN-RDD鉴定OH位点的灵敏度可达nM，且可诱导OH两侧C-C裂解，比传统的鉴定方法更具有可信度。
图2
接着，作者建立了基于TPN -RDD的反相色谱工作流程，并对PE 16:0/HETE、PE 16:0/HODE的一系列OH位置异构体进行了OH位点分析。由于RDD无法提供oxPE中的C=C位置信息，作者还开发了针对oxPE的PB-MS/MS方法。经过PB反应试剂筛选，苯甲酰甲酸甲酯（MB）能够提供较高的PB反应产率（43%）及丰度较高的C=C诊断离子，因此被选作oxPE的PB反应试剂。作者通过制备色谱对OH位置异构体进行分离，而后对各异构体分别进行PB-MS/MS分析，发现PB-MS/MS可同时提供oxPE中共轭及非共轭C=C的位置信息。更重要的是，对于那些RDD只能对其OH位点进行定域的结构来说，如11-HETE，结合PB-MS/MS所提供的C=C位置信息，便可以进一步确定OH位点。
最后，作者利用基于TPN-RDD的反相色谱工作流程对大豆15-脂氧合酶（15-LOX）的牛肝脂质提取物中的oxPE进行了OH位点鉴定，一共鉴定出24种具有特定OH位点的oxPE分子，这些oxPE的OH位点均在n-6位。以PE 38:5（OH）为例，其被鉴定为PE 18:1_20:4(15-OH)、18:0_20:5(15-OH)、16:0_22:5(17-OH)的OH位置异构体混合物，其中16:0_22:5(17-OH)与18:1_20:4(15-OH)同时存在C=C位置构体。
图3
综上，这项工作提供的这样一种结合策略可以实现oxPEs中OH和C=C位置解析。RDD-MS/MS能够明确鉴定或限制oxPEs中的OH位点；作为RDD的补充，PB-MS/MS则提供共轭及非共轭C=C位置信息。此外，RDD方法可以很容易地结合到RPLC-MS/MS工作流程中，从而能够高灵敏（LOD ~1 nM）地从复杂混合物中鉴定oxPE分子。
本文编辑：林巧红
本文审核：瑕瑜 简瑞君
本文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00792
