清华大学化学系瑕瑜教授课题组于近期在Analytical Chemistry杂志上发表了题为“Shotgun Lipidomic Profiling of Sebum Lipids via Photocatalyzed Paternò-Büchi Reaction and Ion Mobility-Mass Spectrometry” 的论文，第一作者是博士生施恒学。此研究中，该团队开发了一种基于离子淌度-质谱、Paternò-Büchi反应-MS/MS (PB-MS/MS)的鸟枪法分析流程，实现了对皮脂组超过900种脂质C=C异构体的快速及灵敏分析。

皮脂是皮脂腺的分泌物，构成皮肤的保护层和保湿层。皮脂的无创获取方法及其反映远端器官病理变化的潜力，使其成为理想的生物样本。皮脂由非极性脂质组成，主要包含蜡酯（WE）、脂肪酸（FA）、甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）、胆固醇酯（CE）及角鲨烯（SQ）。非极性脂质的电离效率低，且其同分异构体和同重素的多样性为皮脂组的分析带来了挑战。本研究旨在通过发展高效率电荷标签PB衍生反应，结合电喷雾电离-离子淌度-串联质谱实现对皮脂组在精细结构层级上的定性定量。

首先，研究者们使用电荷标签PB试剂ethyl 2-oxo-2-(pyridine-3-yl)acetate （EP）和光催化剂米氏酮对脂质C=C的PB反应进行评估（图1）。以单不饱和蜡酯WE 18:0/18:1(Δ9)（见图2）为例，其经电荷标签PB反应后，离子化效率可提升约1000倍。PB产物的MS² CID产生了指向n-端C=C位置的诊断离子，进一步的pseudo-MS³ CID分析能够识别Δ-端位置，从而实现WE中FA链上C=C位置的特异性鉴定。研究者们还对WE 18:1(Δ9)/18:0进行了PB-MS/MS分析。无论C=C双键是位于FA链还是FOH链，PB-MS/MS均能实现链特异性的C=C位置鉴定。此外，研究者还对SQ的C=C进行了PB-MS¹和PB-MS² CID分析，成功鉴定了SQ中各个C=C双键的位置。

图1 皮脂的PB-MS/MS分析流程和碎裂模式

图2 蜡酯WE 18:0/18:1(Δ9)的PB-MS/MS分析

在鸟枪法分析皮脂时，研究者们采用高分辨率环形离子淌度谱（cyclic IMS）对来自含多一个不饱和度脂质的同位素峰（ [M+2 Da]）进行分离。研究表明，经过10圈cyclic IMS分离（分辨率约260），WE 36:2/WE 36:1 (5:1)的PB产物中，[M+2 Da]干扰由60 %显著降至4 %。此方法相较于反相色谱法（干扰6 %），干扰更少，分离速度也更快（< 250 ms vs. ～30 min）。

基于以上，研究者开发了皮脂的分析工作流程（见图3）。首先，他们通过RPLC-APCI-MS定性定量蜡酯的总组成，随后采用结合离子淌度-质谱、PB-MS/MS的鸟枪法分析流程对皮脂进行C=C结构层次的分析。cyclic IMS实现了PB反应后的皮脂中不同脂质亚类、脂质链长不同和不饱和度差异以及同重素干扰的分离。此外，cyclic IMS还可以提升PB-MS/MS对脂质C=C异构体的鉴定能力。以皮脂中的WE 36:1为例，PB-MS/MS产生的C=C诊断离子经过一圈的cyclic IMS分离，其淌度到达时间与C=C位置（m/z）呈现线性关系。研究者们沿着该线性关系的趋势，可发现2个相对丰度低于0.3%的诊断离子。这一发现表明，在即便缺少脂质C=C位置异构体标准品的情况下，基于PB-MS/MS诊断离子的IMS到达时间的线性关系，可以提高对低丰度C=C位置异构体的鉴定能力。

图3 皮脂的分析工作流程

PB-MS/MS显著拓展了对皮脂样本中脂质的丰富性的认知。以WE 36:1为例，研究者们实现了对其含有的31种C=C异构体的定性和定量分析（图4a）。进而，针对WE总碳数为C28至C42，研究者们实现了链特异性C=C位置异构体的定量分析（图4b），共计600个的C=C异构体。

图4 皮脂中WE链特异性C=C异构体定性定量分析

综上，研究者们结合PB-MS/MS和离子淌度-质谱法，开发了对皮脂组WE、TG、DG和CE的C=C位置异构体的鸟枪法快速分析流程，实现了共计超过900个C=C异构体的定性定量分析。

本文编辑：施恒学 

本文审核：瑕瑜

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00141