二硫键在蛋白质的结构稳定及功能调节中发挥着重要的作用。因此，鉴定二硫键的连接方式是蛋白鉴定中不可或缺的一部分。近期瑕瑜教授课题组在Analytical Chemistry上发表了题为“Photochemical Disulfide–Ene Modification Enhances Protein Sequencing and Disulfide Mapping by Mass Spectrometry”的文章，本文第一作者为在读博士生杨晓月，本文拟发展一个能运用于蛋白体系的可调节的在线光化学还原反应，它可以在秒级的时间尺度上同时实现二硫键的还原和烷基化。二硫键-烯烃反应将二硫键断裂和硫醇-烯反应整合为一个体系，显著提高了二硫键断裂和修饰的效率。

此前，瑕瑜课题组发展了一种快速可调节的二硫键还原方法，即在1:1（v:v）异丙醇（IPA）和水的溶剂体系中加入1%丙酮作为光引发剂引发反应，光反应器可直接连接质谱仪或接入LC-MS分析平台上，满足蛋白质鉴定的各种需求。对于含一个或多个二硫键的肽，还原程度可以从部分还原到完全还原自由调节。然而，蛋白质和多肽通常是带有多个电荷的离子。在进行部分还原时，m/z变化较小，不利于后续质量隔离以及串联质谱分析。

与普通的二硫键还原反应相比，二硫键-烯烃反应可以通过添加烯烃快速分离出不同还原程度的产物，便于后续的串联质谱结构鉴定。同时，烯烃能很好地阻断游离巯基进一步反应，有效地降低错配概率。

如图1所示，在丙酮作为光引发剂，异丙醇（IPA）和水1:1（v:v）作为溶剂体系的二硫键还原反应的基础上，引入烯烃，烯烃能够和还原后的巯基反应，最终表现为二硫键-烯烃反应。硫醇-烯反应研究表明，富电子、低位阻和高环张力的双键化合物具有较高的反应活性。因此测试了一系列烯烃，如端烯、乙烯基醚、二氢呋喃、降冰片烯和β-石竹烯（图1）。实验表明，降冰片烯是最适合二硫键-烯反应的烯烃，其反应速度快，同时引起的m/z变化明显。

图1 二硫键-烯烃反应（a）反应示意图（b）二硫键-烯烃反应的待选烯烃

   为了进一步证明二硫键-烯烃反应对不同还原程度产物的分离能力，采用自上而下的方法对溶菌酶（含4对二硫键）进行了分析，并与第二章中的丙酮引发的还原反应结果进行了比较。在2s紫外光照射后，丙酮引发还原样品中完整的[M+12H]¹²⁺离子转化为多个不同二硫键还原程度产物的混合物。经过对不同还原程度产物的同位素拟合计算出此时这个反应后的产物由32%的2个、43%的3个和25%的4个二硫键还原的产物组合而成，而且由于带的电荷较多，这些不同还原程度的产物的质荷比变化很小，难以区分开。相比之下，单个降冰片烯的质量为 94 Da，[M+12H]¹²⁺离子在2秒内部分转化为二硫键-降冰片烯产物[^EM+12H]¹²⁺（图2）和[^2EM+12H]¹²⁺（图2），成功将部分还原产物分离开来。根据同位素分布计算出单烯加成峰主要由一个（52%）和两个（42%）二硫键还原产物贡献，而双烯加成峰主要由由两个（60%）和三个（24%）二硫键还原产物贡献。虽然不能直接分开不同还原程度的产物，但是此信息为判断二硫键还原程度以及后续串联质谱实验提供了一定的参考。Top-down结果分析使用Ying Ge课题组开发的MASH软件，二硫键-烯烃反应溶菌酶样品的序列覆盖率达到70%，且这个实验只需要使用简单的CID技术，应用更加广泛。

图2 溶菌酶二硫键-降冰片烯反应

此外，如果二硫键的还原反应可以与LC-MS在线联用，使含二硫键肽的检测和表征流程化，从而提高分析的灵敏度和通量。由于降冰片烯不带电、易挥发，经色谱分离后与可以光引发剂一起泵入流出液，在微反应器中实现在线反应，而且对质谱信号没有显著影响，如图3所示。最终通过牛血清白蛋白的酶解产物的二硫键-烯烃反应成功鉴定了其17个二硫键当中的11个二硫键，缩小了2个二硫键的范围，4个二硫键由于酶解片段的丰度及离子强度不高没有被检测到。

图3 牛血清白蛋白酶解产物P11片段的在线二硫键-烯部分还原

   综上所述本工作报导了一种快速的（秒级）254nm紫外光引发的多肽和蛋白质的二硫键-降冰片烯反应，并通过在线反应偶联质谱（MS）实现了自上而下方法的序列分析和自下而上方法的二硫键连接方式的鉴定。

编辑：杨晓月

审核：周柯汀