甘油脂 (GLs) 对细胞脂质稳态至关重要，而 GLs 代谢失调通常与人类相关代谢疾病的发生或进展有关。 因此，在分子结构层面上，分析GLs的变化可以进一步了解相关代谢疾病的病理生理学，并促进脂质生物标志物的发现。 目前质谱 (MS) 是分析GLs的首选方法，但传统的 MS 方法无法区分两种主要类型的结构异构体，即碳碳双键 (C=C) 位置异构体和sn-位置异构体 (脂肪酰基链可以连接到甘油骨架上的不同位置) 。近日，瑕瑜课题组与上海Waters科技有限公司徐永威，袁铭和Kate Yu合作，开发了针对GLs的高通量脂质组学工作平台，利用C=C的电荷标记 Paterno-Büchi (PB) 衍生化反应、超临界流体色谱 (SFC) 和串联质谱 (MS/MS) 实现对GLs的快速、灵敏的结构分析。
开发的工作流程具有三个技术特征：(1) 25 分钟 SFC 分离，能够分离 2-乙酰吡啶 (2-acpy) 衍生化前后甘油二酯 (DGs) 的sn-异构体以及不同碳数 (CN) 和双键数 (DBN) 的甘油三酯 (TGs) ，(2) 快速2-acpy 电荷标记 PB 衍生化 (30 s光化学反应)，以及 (3) 时间排列平行碎裂 (TAP，TimeAligned Parallel Fragmentation) 能够以高通量方式对 PB 衍生后的脂质进行多级MS/MS，并允许精确定位特定脂肪酰基链的 C=C 位置。该工作流程揭示了人血浆中的 500 多种甘油酯分子结构的存在。通过比较2型糖尿病 (N = 7) 和对照组 (N = 7) 之间人血浆样品，发现九组 TG 和 DG 的异构体组成 (C18:1 Δ9 与 Δ11) 发生显著变化。相关工作“Deep Structural Annotation of Glycerolipids by the Charge- Tagging Paterno–Büchi Reaction and Supercritical Fluid Chromatography–Ion Mobility Mass Spectrometry”近日发表在Analytical Chemistry上。第一作者为2018级博士生夏天。
作者首先使用10 mM 2-acpy和30 s紫外线照射 (254 nm波长) 对不饱和GLs 进行电荷标记光化学衍生。对PB衍生化后GLs进行MS2 CID，会产生一对丰度最高的C=C诊断离子 (n-xFO/ n-xfO)，其中包含甘油骨架的C=C诊断离子定义为 n-xFO，而从C=C 位置裂解，包含烷基链甲基末端的碎片离子表示为 n-xfO，其中“x”代表C=C从脂肪酰基链的甲基端开始计数的位置，而下标“O”表示该片段在裂解位点含有烯烃结构(图1) 。该对C=C诊断离子 (n-xFO/ n-xfO) 可以用于指认双键从末端甲基算起的位置。然而，当甘油酯存在多个不饱和脂肪酰基时，依然无法确定C=C属于哪条不饱和链。因此，有必要对n-xFO离子进行MS3 CID。n-xFO离子的MS3 CID将产生 ΔyAO离子，ΔyAO离子的产生是源于甘油骨架的中性丢失，其中“y”代表C=C从脂肪酰基链中的羧基端开始计数的位置。x和y之和等于碳碳双键所在脂肪酰基链的碳数。而对n-xFO离子进行MS3 CID，作者是通过Waters Synapt XS高分辨质谱的TAP功能来实现的。在此功能中，母离子在第一个碰撞室 (TRAP) 产生二级碎片离子，二级碎片离子进入行波离子淌度池 (T-Wave淌度分离区) ，二级碎片离子根据各自淌度漂移时间实现进一步分离；分离后的二级碎片离子则在第二个碰撞室 (TRANSFER) 中依次分裂，从而生成多个二级离子的 MS3 CID 谱。
图 1
基于该流程，作者在人血浆脂质提取物中，在 C=C 位置层面上共鉴定了464 个 TG和31个胆固醇酯 (CE) 的分子结构，并准确鉴定62 个 DG 的sn位置和 C=C 位置。其中，对于脂肪酰基链C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1 和 C19:1，Δ9 是主要 C=C 位置异构体。 对于 C18:3 和 C22:5，观察到 ω-3 和 ω-6 异构体，即 C18:3(Δ9,12,15)/C18:3(Δ6,9,12)和C22:5(Δ7,10,13,16,19)/C22:5-(Δ4,7,10,13,16)。作者还发现了人血浆样品中含有C18:1的DG和TG中, Δ11异构体相对含量(Rel.%Δ11) 通常小于10%，并在2型糖尿病 (N = 7) 人血浆样品中，发现九组含有C18:1的TG和DG Δ11异构体相对含量有所下降。这一发现可能为理解与T2D相关的脂质代谢失调提供新的见解 (图2) 。
图2
本文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01379
原文引用：DOI: 10.1021/acs.analchem.1c01379
撰稿：夏天
审阅：谭镇枢
