最近，清华大学瑕瑜教授课题组和中国医学科学院北京协和医学院张金兰研究员课题组在Analytical Chemistry杂志上发表题为“Profiling of Cholesteryl Esters by Coupling Charge-Tagging Paternò−Büchi Reaction and Liquid Chromatography−Mass Spectrometry”的论文，该文的通讯作者为瑕瑜教授，第一作者为谢小波博士。这项工作的特点是以2-乙酰吡啶为电荷标记Paternò−Büchi (简称PB)反应试剂，离线反应后与RPLC-MS/MS结合，以实现高灵敏、高结构解析度的胆固醇酯分析方法。
胆固醇酯(Cholesteryl esters,简称CE)是脂肪酸与胆固醇的3-羟基酯化生成的人类必需脂质，是脂蛋白在运输和储存胆固醇时的主要形式。CE和胆固醇之间稳态的扰乱与肥胖、动脉粥样硬化和癌症等多种疾病有关。由于CE的脂肪酰基碳的数量(从0到40)和不饱和程度(从0到8)不同，其结构呈现多样性。对不同生理情况下CE精细结构组成和含量变化的分析有利于生物标志物的发现。目前对CE的主要分析方法是GC-MS和ESI-MS/MS。GC-MS需要将CE先水解再甲酯化。由于CE是中性脂质，ESI-MS/MS通常对其与NH4+、Li+或Na+的加合物进行分析，但无法得到不饱和酰基链C=C双键的位置信息。此前，本课题组使用丙酮作为PB试剂和nano-ESI共溶剂分析CE，但锂离子加合物限制了其灵敏度。近来，Helies课题组发展了电荷标记的PB试剂乙酰吡啶，为不饱和中性脂质碳碳双键高灵敏度鉴定带来了可能。
首先，作者评价了一系列含氮羰基化合物作为电荷标记的PB试剂用于CE正模式的分析，2-乙酰吡啶由于PB产率高、副反应少，CID形成诊断离子效率高等优点被选用。2-乙酰吡啶和双键经过254 nm的紫外光照发生PB反应形成两种含四元环产物，经CID碎裂生成含烯基末端的诊断离子xFO和xfo，用以确定酰基链C=C位置(如图1)。然而CE与脱氢胆固醇酯(DHE)可为结构异构体。通过对xFO进行CID串联质谱可以区分甾醇骨架的异构体，进一步碎裂产生的xAO可以明确得到脂酰链上的双键位置，实现区分DHE 18:2和CE 18:3。由于2-乙酰吡啶衍生化后提高了电离效率和减少了源内碎裂，该方法对CE 18:1(9Z)的检测限达到0.25 nM,比使用丙酮作衍生化试剂进行PB-MS/MS的检测限(0.1 μM)灵敏百倍。
图 1
作者将离线的2-乙酰吡啶PB反应与RPLC-MS/MS结合构建了CE的分析流程。RPLC能根据酰基链长度和不饱和程度将CE分开，从而大大降低了离子抑制和+2 Da的同位素干扰。运用此流程，作者们从人血浆中鉴定出了12种饱和CE和21种不饱和CE亚类，其中包含27种不饱和双键位置异构体 (图2)。 此方法优于从GC-MS (Sansone, A et al., PLoS One, 2016)、OzID (Marshall, D. L. et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2019)和以丙酮为衍生化试剂直接注射的PB-MS/MS方法(Ren, J. et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2017)。这是因为电荷标记试剂2-乙酰吡啶提高了灵敏度以及RPLC-MS/MS的使用减少了化学干扰。
图 2
综上所述，本工作将离线的2-乙酰吡啶Paternò−Büchi反应与RPLC-MS/MS结合，发展了可对复杂样品中胆固醇酯进行高结构解析度、高灵敏度的鉴定和定量方法，为CE代谢通路研究和疾病标志物筛选提供了更大的可能。
本文编辑：简瑞君 审核：赵婧
本文链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.analchem.0c01241
本文引用：10.1021/acs.analchem.0c01241
