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Xia Lab-Radical Mass Spectrometry

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Paternò-Büchi衍生化与串联质谱联用深度分析缩醛磷脂

近期,清华大学化学系瑕瑜教授课题组在Analytical and Bioanalytical Chemistry杂志上发表了题为 “Deep profiling of plasmalogens by coupling the Paternò–Büchi derivatization with tandem mass spectrometry” 的文章。论文第一作者为清华大学化学系2021级博士生王祎纯,通讯作者为瑕瑜教授。在该研究中,作者通过结合离线Paternò-Büchi反应与液相色谱-串联质谱,开发了一套灵敏的工作流程,用于深度分析生物样品中的缩醛磷脂。

缩醛磷脂(Plasmalogens)是甘油磷脂(Glycerophospholipids, GPs)的一个特殊亚类,在甘油主链的sn-1位置含有乙烯醚键(-C=C-O-),在sn-2位置富含多不饱和脂肪酰基。缩醛磷脂参与炎症信号转导,与神经退行性疾病、癌症等多种疾病有关。质谱是脂质组学研究的有利工具,然而,复杂生物样品中往往存在多种同分异构体及同重素,对缩醛磷脂的质谱分析造成了干扰。目前基于二级碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation, CID)的方法仅可区分互为同分异构体的PE-P与PE-O,但难以区分PC-P和PC-O。

另外,已有技术对缩醛磷脂C=C双键水平上的鉴定灵敏度不足。臭氧诱导解离(OzID),紫外光解(UVPD)以及有机物离子的电子冲击激发(EIEIO)等技术仅从生物样品中鉴定<20个缩醛磷脂。而使用丙酮作为PB试剂的Paternò-Büchi反应结合串联质谱技术(PB-MS/MS)因存在较高程度的副反应,导致灵敏度不理想(100 nM),需要进行二次衍生化以提高检测限。此外,目前也缺乏一个完整的PB-MS/MS工作流程可以同时实现PE-P和PC-P的分析。针对以上存在的分析挑战,作者开发一套简单、灵敏的工作流程,可以从复杂样品中深度分析PC-P和PE-P。

首先,作者使用标准品PE P-18:0/18:1(Δ9Z)和 PC P-18:0/18:1(Δ9Z),筛选了一系列PB试剂并仔细优化了PB反应条件。作者使用两个参数来评价PB试剂的性能:PB产率和C=C诊断离子相对丰度,其中PB产率指的是反应后PB产物的提取离子色谱(EIC)与紫外线照射前脂质的提取离子色谱(EIC)比例,C=C诊断离子相对丰度指C=C位置相关诊断离子总丰度归一到PB-MS2 CID中片段离子的总丰度的比例。实验结果表明:triFAP表现出最佳的性能。triFAP-MS2 CID测定PE P-18:0/18:1(Δ9Z) 检测限为20 nM,比使用丙酮-PB-MS/MS低5倍,且测定PC P-18:0/18:1(Δ9Z)(10 nM)的检测限也优于丙酮(15 nM)。综上所述,triFAP比丙酮更适合缩醛磷脂的鉴定。

随后,作者建立了使用triFAP作为PB试剂的PB-HILIC-MS/MS工作流程,用于分析复杂生物样品中的缩醛磷脂(图1)。首先使用Folch方法提取复杂样品的全脂,通过HILIC-+‘ve MS1 在总组成水平上鉴定出PE-O和PC-O并进行相对定量,再通过PB-HILIC-+‘ve MS2 CID在链组成水平和C=C双键水平上定性定量PE-P和PC-P异构体。

图1 从复杂生物样品中深度分析缩醛磷脂的工作流程

通过此工作流程,作者成功在牛心脏全脂中鉴定出73种PE-P 和31种PC-P,并实现了链组成水平和C=C双键水平上的相对定量。

图2 牛心脏中缩醛磷脂链组成异构体(b)和C=C双键异构体(c)相对定量

作者进一步对胶质瘤(N=6)和正常(N=6)人脑组织的缩醛磷脂进行了深度分析。实验表明,相对于正常人脑组织样本,胶质瘤样本中PE P-34:1、PE P-36:1和PE P-36:2中n-10异构体含量显著增加。此外,基于14组表现出显著变化的异构体,成功实现了对胶质瘤组和正常组的聚类,这在总组成水平上是无法实现的。

图3 胶质瘤与正常人脑样品中缩醛磷脂的分析

综上所述,作者开发了一套灵敏的工作流程,通过将离线triFAP衍生化与HILIC-MS/MS相结合,在链组成和C=C位置异构体水平上深度分析缩醛磷脂。使用该方法从牛心脏脂质中鉴定了73个PE-P和31个PC-P。对人类胶质瘤和正常脑组织样本的分析显示,胶质瘤组织样本中PE-P的n-10 C=C异构体升高。这些发现表明,此工作流程在研究临床样品中缩醛磷脂的代谢变化方面具有潜力。

最后感谢国家自然科学基金委(No. 22225404)、国家科技部重点研发计划(2018YFA0800903)提供的经费支持。

本文编辑:王祎纯 

本文审核:瑕瑜

原文链接:https://doi.org/10.1007/s00216-024-05376-9

Created: Jun 17, 2024 | 16:54

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