Xia Lab-Radical Mass Spectrometry

氮氧自由基诱导解离结合液相色谱-质谱用于支链脂肪酸分析

近日,瑕瑜课题组在Analyst上发表题为“Profiling of  Branched-Chain Fatty Acids via Nitroxide Radical-Directed Dissociation Integrated on an LC-MS/MS Workflow”的文章。该文的第一作者是清华大学化学系2019级直博生简瑞君,通讯作者是瑕瑜教授,清华大学化学系2017级直博生赵雪和林巧红参与此工作。作者利用碰撞诱导解离产生氮氧自由基,氮氧自由基进而在脂肪酸碳链上诱导解离产生链内碎片,用于定位支链脂肪酸中甲基位点。此自由基诱导解离串联质谱技术被整合到反相高效液相色谱,实现了对牦牛奶粉和人血浆中的支链脂肪酸分析。

脂肪酰基上的链修饰,如甲基分支,对调节脂类的生物化学和生物物理性质具有重要意义。细菌甘油磷脂膜中含量丰富的支链脂肪酸可增加双层膜的流动性;对于哺乳动物来说,支链脂肪酸富含在皮肤、分泌物和新生胎儿的皮脂中。除内源性合成外,乳制品是人体支链脂肪酸的主要来源。有研究者发现支链脂肪酸对抗肿瘤和抗炎症有着积极的作用。目前的脂类分析流程主要依靠碰撞诱导解离(CID)来获取脂类的结构信息,然而电喷雾离子化技术引入的偶电子离子通过CID主要导致极性键断裂,无法定位链上的修饰。 自由基诱导解离(RDD)是一种新型的串联质谱(MS/MS)方法,能够产生链内裂解,从而可以详细表征脂质结构。对于脂肪酸的自由基诱导碎裂,目前主要通过引入芳基-碘键再结合紫外光解离引入苯基自由基1,低能碰撞诱导解离方法还有待发展。

 

图1 (a)脂肪酸O-BHA的衍生 (b)FA-O-BHA锂加合物碎裂产生氮氧自由基及后续RDD

 

作者们利用商业可购得的O-苄基羟胺(O-BHA)氮氧-苄基键键解离能低 (BDE, 32 kcal/mol) 的性质,在CID 条件下其锂离子加合物丢失苄基自由基产生脂肪酰基-氮氧自由基 ([FA-NO]+•),随后诱导了脂肪碳链的RDD(如图1)。甲基分支的位置可以通过在支链两端间距28Da的碎裂峰的特征来确定,并且靠近羰基的支链端碎裂有着明显的增强。

图2 a)标准品FA n-,i-,ai-17:0的色谱分离 b) [FA-OBHA+H]+的MS2 CID谱图 c)支链异构脂肪酸的色谱面积比值与浓度比值标准曲线。

支链异构体RDD的链内片段具有重叠的m/z; 因此,为了实现复杂样品中支链脂肪酸的鉴定,作者们使用C18反相柱对支链脂肪酸进行分离 (如图2a),通过Tee型三通柱后加入醋酸锂的方式(混合后~200 μM) 实现FA-O-BHA锂离子的加合。通过[FA-O-BHA+Li]+的MS2 CID实现支链脂肪酸的鉴定,检测限~50 nM; 通过加氢峰在酰胺键的断裂 ([FA-OBHA+H]+m/z 124)实现支链脂肪酸的定量,检测限~1 nM。

图3 人血浆中a)总FAs的分布  b)支链异构的相对组成 c) FA 17:0色谱分离图 d) FA n-5 17:0的鉴定

使用以上分析方法,作者们将人血浆中饱和脂肪酸数目由不含支链异构信息的19增加到含支链异构的30个,其中有7组碳数的脂肪酸含支链异构体。而奇数链的FA 13:0,15:0和17:0含有较多ai-和i-构型的支链异构,支链成分占40%左右。含偶数链的FA 14:0,16:0,18:0和24:0只有i-构型的支链异构,且C14-C18直链成分大于99.5%。值得注意的是,我们发现了一种此前血浆中没被鉴定到过的支链处于从甲基末端计算处于第5个碳(n-5)的FA 17:0(如图3c,d),其在血浆FA 17:0中的比例为4.7%,而总体FA 17:0只有16:0的2.3%。

综上,本文开发了一种基于商业易得的O-BHA衍生化由CID触发的RDD方法用于支链脂肪酸的结构表征,结合反相色谱实现了复杂样品中支链脂肪酸的表征,还在人血浆中发现了此前未报道过的FA n-5 17:0。未来我们计划采用含固定电荷的衍生化,以克服锂离子加合物带来的局限性。

本文编辑:简瑞君

本文审核:瑕瑜 王紫丹

 本文DOI: 10.1039/D2AN00266C

参考文献:1.      V. R. Narreddula, N. R. Boase, R. Ailuri, D. L. Marshall, B. L. J . Poad, M. J. Kelso, A. J. Trevitt, T. W. Mitchell and S. J. Blanksby, Anal. Chem., 2019, 91, 9901-9909.

Created: May 03, 2022 | 14:11